СепТех

Передовые технологии фильтрации и водоподготовки



Депирогенизация на ионообменных мембранах

Достижение стерильности инъекционного препарата является лишь одной стороной решения задачи. Очень важно обеспечить ещё и депирогенизацию стерильных лекарственных растворов в процессе их производства.

Эндотоксины – липополисахариды, входящие в состав клеточной мембраны грамположительных бактерий, - являются пирогенами, которые необходимо удалять из фармацевтических препаратов, растворов для инъекций и некоторых сред для культур тканей.

При разработке схемы депирогенизации растворов, содержащих белки и пептиды, необходимо учитывать множество факторов: тип соединения, подвергаемого очистке; концентрацию электролитов; рН раствора; наличие в растворе других белков или пептидов и их концентрации; молекулярный вес белков и их изоэлектрическую точку; характер межмолекулярных взаимодействий. Совокупность этих факторов определяет выбор наиболее эффективного метода удаления пирогенов.

Известно, что молекулярный вес эндотоксинов лежит в диапазоне от 10 до 1000 кДа. Если подвергаемый депирогенизации раствор содер¬жит низкомолекулярные соединения (буфер, раствор аминокислот, нуклеотидов, коротких пептидов), то отделить эндотоксины можно ультрафильтрацией, используя кроссфлоу фильтры на 10 – 20 кДа. Однако, в тех случаях, когда белок имеет молекулярный вес, близкий к весу эндотоксина, ультрафильтрация для отделе¬ния эндотоксина непригодна.

Использование адсорбционных матриц, в частности смол для хроматографии, на сегодняшний день является одним из главных методов депирогенизации. Метод основан на различии во взаимодействии эндотоксина и компонентов раствора с функциональными группами, иммобилизованными на смоле. Поскольку эндотоксины обладают низким значением рI(изоэлектрической точки), то в большинстве растворов они имеют отрицательный  заряд. В растворах, рН которых находится в диапазоне между рI эндотоксина и белка, белок и эндотоксин будут противоположно заряжены. Таким образом, наиболее часто при  депирогенизации используют ионообменные смолы.

Некоторые свойства смол для хроматографии ограничивают возможности их применения. Имеются в виду такие проблемы, как низкие скорости потока, длительное время регенерации, ограниченная химическая стабильность.

Использование мембранных адсорберов позволяет избежать этих проблем. Высокоэффективные и простые в использовании ионообменные мембраны для депирогенизации могут быть использованы как в лабораторных, так и в промышленных масштабах.

Адсорбционные матрицы Sartorius представляют собой мембраны из модифицированной целлюлозы с крупными размерами пор (3-5 мкм).

На поверхности пор мембранные адсорберы Sartobind имеют ковалентно связанные ионные функциональные группы. Адсорберы обладают высокой динамикой связывания и химической стабильностью. Эти свойства мембранных адсорберов позволяют быстро и эффективно удалять нежелательные примеси (эндотоксины, ДНК, белки) из различных растворов. Высокая плотность, равномерное распределение и доступность функциональных групп делают процесс адсорбции во время движения жидкости через поры высокоэффективным.

Мембранные адсорберы Sartobind выпускаются в виде одноразовых насадок с эффективной площадью 5 см2 (МА5), многоразовых насадок с эффективной площадью 15 см2 и 100 см2 (МА15 и МА100), а также в виде дисков 142 и193 мм диаметром под соответствующие держатели.

Для крупномасштабных производств также выпускаются мембранные адсорберы Sartobinda в форм? факторе патронных элементов, в которых мембрана упакована в виде многослойного пакета, который может содержать 5, 10, 15, 30 и 60 слоёв. Ёмкость таких адсорберов может достигать десятков грамм белка.

Эти адсорберы могут применяться не только для депирогенизации белковых растворов, но и для разделения белков методом высокоэффективной хроматографии.

Существует два варианта удаления эндотоксинов с использованием мембранных адсорберов:

1. Используется анионообменник (тип Q) и буфер, рН которого ниже изоэлектрической точки ионизации (pI) белка. В этом случае эндотоксин будет связываться с функциональными группами на мембране, в то время как белок будет проходить через мембрану.

2. Используется катионообменник (тип S) и буфер с рН ниже pI белка. Здесь эндотоксин будет проходить сквозь мембрану, а белок связываться на мембране, после чего смывается соответствующим буфером.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют пути депирогенизации, условия и результаты, полученные на растворах очищенного или природного эндотоксина. Все растворы были предварительно профильтрованы через мембранные фильтры из ацетата целлюлозы фирмы Sartorius (0,2 или 0,45 мкм). Предфильтрация с использованием мембран из ацетата целлюлозы позволяет избавиться от частиц, которые могут блокировать мембраны адсорберов Sartobinda, при чем материал предфильтра исключает адсорбцию белков и эндотоксинов. Содержание эндотоксинов в приведенных примерах определялось методам gel clot (гель-тромб тест) с использованием, при необходимости, серийных разведений проб.

Чувствительность LAL метода – 0,06 единиц эндотоксина/ мл (1 единица/ 100 пг)

Таблица 1.Белок:  бычий сывороточный альбумин (БСА). Sartobind: Q15 и Q100. Образец: БСА (pI 4.7), растворенный в воде для инъекций, концентрация белка – 1 мг/мл, pH 4.7. Концентрация эндотоксина (E.coli 055:B5) – 6 и 10 Ед/мл.

Процедура: Перед использованием мембранного адсорбера проводили его депирогенизацию, для чего через Q15 пропускали 20 мл 1N раствора NaOH, выдерживали адсорбер в щелочи в течении 1 часа, а затем промывали 100 мл апирогенной воды. Последнюю каплю промывочной воды подвергали LAL-тесту для проверки на отсутствие пирогенов. Аликвоты в 150 мл пропускали через несколько насадок Sartobind Q15 и Q100. Пятнадцать фракций фильтрата по 10 мл каждая от каждого образца исследовали на содержание эндотоксинов с помощью LAL-теста.

Скорость потока: 5 – 20 мл/мин с использованием перистальтического насоса.

В описанном выше эксперименте pH буфера не был оптимальным. Более эффективное удаление эндотоксина может быть достигнуто при использовании буфера с pH ниже 4.7. При таких условиях БСА будет проходить через Sartobind Q, не адсорбируясь, в то время как эндотоксин будет связываться. Время, необходимое для уменьшения концентрации эндотоксина на 2 порядка в образце 150 мл: 15-25 минут

таблица 1

Образец

Содержание эндотоксина, ед/мл

Логарифм уменьшения

концентрации

До Q

После Q

Q151 150 мл

6

< 0.06

> 2

Q152 150 мл

6

< 0.06

> 2

Q153 150 мл

6

< 0.06

> 2

Q1001 150 мл

9.9

от 0.235 до< 0.06

от 1.6 до > 2.2

Q1002 150 мл

9.9

от 0.235 до< 0.06

от 1.6 до > 2.2

Q1003 150 мл

9.9

от 0.235 до< 0.06

от 1.6 до > 2.2

Таблица2. Белок: g-глобулин Sartobind: Q100. Образец: g-глобулиновая фракция (pI 7-8), растворенная в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.5, смешанная с эндотоксином из E.coli (055:В5), концентрация – 101 Ед/мл.

Процедура: аликвоты образца 500 мл пропускались через несколько Q100. Пять фракций фильтрата по 100 мл от каждой аликвоты отбирались и исследовались на содержание эндотоксина.

Скорость потока: 10-20 мл/мин. Время, необходимое для уменьшения концентрации эндотоксина на 3 порядка в образце 500 мл: 25-50 минут.

Таблица 2

 

Образец

Содержание эндотоксина, ед/мл

Логарифм уменьшения концентрации

 

До

Q100

  После Q100

 

Q1001 500 мл

101

< 0.06

> 3.2

Q1002 500 мл

101

< 0.06

> 3.2

Q1003 500 мл

101

< 0.06

> 3.2

Заключение

Высокая химическая стабильность адсорберов Sartobind позволяет использовать агрессивные агенты для регенерации и депирогенизирующей обработки. Так как сама процедура очистки непродолжительна, активность белка сохраняется высокой, и даже нет необходимости в холодном помещении для работы с белком.

Мембранные адсорберы Sartobind эффективны для быстрого удаления эндотоксинов из различных растворов.

 

 

Обновлено: 22.03.2007

Версия для печати